Guanidinthiocyanat ist ein starkes Protein-Denaturierungsmittel. Es kann nicht nur Proteine schnell auflösen, zur Fragmentierung der Zellstruktur führen und aufgrund der Zerstörung der Sekundärstruktur nukleare Proteine schnell von Nukleinsäuren trennen, sondern hat auch einen starken Denaturierungseffekt auf RNasen. Daher kann Guanidinthiocyanat als Denaturierungsmittel verwendet werden, um Zellen zu lysieren, RNA von Protein zu trennen und RNA in Lösung freizusetzen. Bei der Herstellung und Verwendung der Guanidinthiocyanatlösung treten jedoch häufig einige Probleme auf. Dieses Papier wird diese Probleme nacheinander beantworten.
Muss jetzt Guanidinthiocyanatlösung verwendet und zubereitet werden?
Die Endkonzentration von Guanidinthiocyanat betrug 4 m als Beispiel: 42 mm Natriumcitrat, 0,83 % n-Laurylsarcosin (Natriumdodecyl, n-Methylglycin), 0,2 mm ²- Herstellung von CSB-Puffer aus Mercaptoethanol; 25 g Guanidinthiocyanat und 33 ml CSB-Pufferlösung werden gemischt, bis sie vollständig gelöst sind. Die denaturierte Lösung kann durch Erhitzen und Auflösen bei 65 °C hergestellt werden℃ und gespeichert bei 4℃ für Standby.
Daher muss jetzt keine Guanidinthiocyanat-Lösung verwendet und hergestellt werden, und es gibt derzeit Lösungen in verschiedenen Konzentrationen auf dem Markt, aber die Lagerzeit ist nicht einfach zu lang, da es sonst zu Ausfällungen kommt, die vor Gebrauch sorgfältig geprüft; Außerdem empfiehlt es sich, bei zu vielen einmaligen Vorbereitungen umzupacken.
Muss die Guanidinthiocyanatlösung nach der Zubereitung sterilisiert werden?
Es ist nicht notwendig, Guanidinthiocyanatlösung zu sterilisieren, die nicht sehr stabil ist, und 0,1% DEPC-Wasser wird im Allgemeinen mit Pyrolyselösung verwendet, und das Wasser wurde sterilisiert. Außerdem müssen alle Reagenzien zur Extraktion von RNA mit DEPC-Wasser zubereitet werden, und das Reagenz sollte neu geöffnet und ausschließlich für RNA verwendet werden.
Obwohl das vorbereitete Lysat nicht sterilisiert werden muss, ist zu beachten, dass die im Experiment verwendeten Kunststoffprodukte als RNase-frei gekennzeichnet sind. Wenn sie nicht zur Verwendung geöffnet wurden, können sie direkt verwendet werden. Andere müssen behandelt werden: DEPC in doppelt destilliertes Wasser geben, um seine Endkonzentration auf 0,1% zu erreichen, die Kunststoffprodukte darin einweichen, die Küche über Nacht lüften und dann mit Aluminiumfolie versiegeln, Hochtemperatur- und Hochdrucksterilisation für mindestens 30 Minuten, trocken und Standby.
